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將動物組織或細胞分散成單個細胞，在模擬機體內的生長環(huán)境條件下，使其在體外環(huán)境繼續(xù)生長增殖的過程，稱為細胞培養(yǎng)。體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)（亦稱初代培養(yǎng)）和傳代培養(yǎng)（亦稱繼代培養(yǎng)）。原代培養(yǎng)是指將機體取出的組織或細胞進行初次培養(yǎng)的過程。初次培養(yǎng)的細胞大約增殖10代左右，這樣的細胞稱為原代細胞。從原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉接培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。在體外環(huán)境條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞稱為傳代細胞。

（一）體外培養(yǎng)的細胞根據其生長方式

1．貼壁型依賴性細胞

生長時需要附著于某些帶適量正電荷的固體或半固體表面，大多數動物細胞體外培養(yǎng)時，均以此種方式生長。非淋巴組織的細胞、多種異倍體細胞也屬此種類型。

2．非貼壁依賴性細貼胞

此類細胞體外生長不必貼壁，可在培養(yǎng)基中懸浮生長，血液、淋巴組織細胞、腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉化細胞系等都屬此類細胞。原則上各種動物組織都可以進行體外培養(yǎng)。而實際上幼體組織比老齡組織更容易培養(yǎng)，尤其是胚胎組織。分化程度低的比分化程度高的容易培養(yǎng)；腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。任何動物細胞培養(yǎng)均須從從原代培養(yǎng)開始。

2.培養(yǎng)方法

（1）取材

首先要對所取動物組織的各種情況做詳細記錄。從動物體內取材必須嚴格遵守無菌操作。所用器皿事前經嚴格的消毒滅菌。采用各種適宜的方法處死動物，取出組織放入小燒杯中，用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎成1mm3大小，用吸管吸取Hanks液沖下剪刀上的碎塊，補加3～5mL Hanks液，用吸管輕輕吹打，低速離心，棄去上清液，留下組織塊。也可用兩手術刀片將組織塊切碎，這樣對細胞損傷較小，但操作時間長，容易污染。對某些軟組織如腫瘤、胚胎、腦等可將碎組織塊放入注射器玻璃管中擠壓分離。也可用1mm、10μm、20μm三種規(guī)格的不銹鋼或尼龍網篩擠壓分離，但對較硬的組織和纖維組織效果不好。

（2）分離

組織消化法是用生物化學的方法將剪碎的組織塊分散成細胞團或單細胞。常用的消化液有：胰蛋白酶適用于細胞間質較少的軟組織，如胚胎、羊膜、上皮、肝、腎以及傳代細胞等。

操作方法：

1）將剪碎的組織塊放入有玻璃珠的三角燒瓶種，加入30～50倍體積的0.25％胰蛋白酶；

2）37℃水浴內消化30～60 min，每5～10 min搖動一次，根據效果可中間更換消化液，靜止10 min，吸去2/3清液。補加新鮮胰蛋白酶；

3）Hanks液漂洗兩次，每次2～3 min；

4）800r/min離心5 min，棄上清液，加入營養(yǎng)液，如有大塊，可用紗網過濾。如消化傳代細胞，可與EDTA混用。

膠原酶——這種用細菌提取的酶對膠原和細胞間質有較強的消化作用。使用于消化纖維組織、上皮組織、癌組織等。此酶步受Ca2+、Mg2+的螯和作用，可用BBS和含血清培養(yǎng)基配制成濃度為200u/ml或0.1～0.3 mg/ml的溶液。其作用溫和，無須機械震蕩。

5）培養(yǎng)瓶中放入1～5 mm3大小的碎組織塊，加5 ml 2000u/mL的膠原酶溶液，使終濃度為200u/ml，pH6.5；

6）36℃水浴24～48 h，視情況可適當延長，無需震蕩，期間可更換酶液一次；

7）見組織塊已變軟，分散于瓶低，輕微震蕩即散成細胞團或單細胞，小心倒出培養(yǎng)液，瓶低可能附著一些巨噬細胞，借此可將其分開，單獨培養(yǎng)或棄之不用；

8）800r/min離心5 min，棄上清液，重懸于BBS液中，在重復離心一次；

9）加入培養(yǎng)液制成細胞懸液用于接種。

其他的酶如鏈酶蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于培養(yǎng)細胞的消化。需根據酶的作用特點及組織成分的不同適當選用。EDTA最適用于消化傳代細胞，常與胰蛋白酶配合用，方法如前所述。

10）細胞計數

細胞懸液制成后，需要計數懸浮液中細胞的濃度，通常以“細胞個數/ml”表示。在培養(yǎng)貼壁細胞或懸浮細胞時也需要檢查培養(yǎng)液中的細胞濃度，檢查方法如下：

在干凈的離心管中加入9滴細胞懸液，在加入0.4%臺盼藍（錐蟲藍）1滴，混勻后靜置2～3 min；將計數板平放在顯微鏡臺上，在蓋片邊緣加入1～2滴染色的細胞懸液，使之完全充滿計數板與蓋玻片間的空間，勿留氣泡，勿使蓋片漂浮。

A. 在顯微鏡下記錄計數板四角四個大格中的細胞總數，原則是染藍的細胞不數（死細胞），無色的細胞計數（活細胞，壓線的細胞，數上不數下，數左不數右，一團細胞按一個細胞計數；

B. 按下列公式計算細胞懸浮濃度：

細胞懸液濃度（細胞個數/ml）=（4大格細胞總數/4）×104×稀釋倍數計數時要注意：如果細胞團數超過10%，說明消化過程進行得不充分；如果細胞數少于20個/mm3或多于50個/mm3說明稀釋不當，需重新操作。

（3）常用培養(yǎng)法

1）組織塊培養(yǎng)法

將組織塊剪切成小塊，直接放入培養(yǎng)瓶（皿）中，貼附一段時間后，細胞從組織塊長出，最終形成單層細胞。該法簡便，適合上皮細胞、骨骼肌細胞的原代培養(yǎng)，更適合組織量少的牙髓細胞原代培養(yǎng)（用蓋玻片條培養(yǎng)法）。

2）懸滴培養(yǎng)法

組織培養(yǎng)是Harrison（1907年）和Carrel（1912年）等首先發(fā)展建立的體外組織培養(yǎng)方法。他們在載玻片或蓋玻片上滴上血漿或淋巴液，將一小片組織埋于血漿或淋巴液中，加胚胎浸出液和血清，混合，血漿凝固固定組織塊，胚胎浸出液和血清提供營養(yǎng)，細胞從外植塊向四周遷移生長。懸滴培養(yǎng)法是最簡單和最原始的培養(yǎng)法。

將培養(yǎng)的組織剪成1 mm3的小塊為宜。圖中使用一片較大的方蓋片和一片小蓋片粘附在一起，是為了換液和傳代方便。加血漿，接種組織，再加胎汁使之與血漿充分混合。稍置片刻待血漿凝固，則組織小塊被凝固于血漿胎汁混合物中。然后取一凹玻片，四角涂凡士林少許，把蓋片反轉粘附在凹玻片上。隨后沿方蓋片四周涂融蠟封閉，勿使其漏氣，置于37℃溫箱培養(yǎng)。

此法細胞生長空間狹小、氣體不足，細胞不能持續(xù)長時間生長，培養(yǎng)基易液化，需要常更新培養(yǎng)基。其次是凹玻片折光，不便于直接觀察活細胞和攝影。

3）卡氏瓶培養(yǎng)法

為了擴大細胞生長面積和空間，Carrel設計了卡氏瓶培養(yǎng)，此法與雙蓋玻片法原理相似，不同的是組織塊被植入到特別的卡氏瓶中培養(yǎng)。細胞在卡氏瓶中，氣體充足，附著面寬闊，營養(yǎng)豐富，細胞能較好地生長，而且卡氏瓶適合觀察。操作方法是：

A．將組織剪切成細小碎塊后，用平衡鹽溶液漂洗。

B．組織碎塊轉移到第二只培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下，將不需要的組織諸如脂肪或壞死的材料，用外科手術刀交叉解剖掉，將組織塊切成約1mm3小塊。

C．用滴管將組織小塊移到消毒離心管或普通容器內（注意吸管在吸組織小塊前，先用平衡鹽溶液弄濕內表面，否則易粘著組織小塊）。靜置使組織小塊下沉。吸去上清液，換入新鮮平衡鹽溶液漂洗組織小塊，如此重復兩到三次。

D．將組織小塊轉移到培養(yǎng)瓶內，每只體積為25 ml的培養(yǎng)瓶內可放置20～30塊組織小塊，吸去液體。在每只25 ml培養(yǎng)瓶內加入1ml生長培養(yǎng)液，輕輕地傾斜擺動培養(yǎng)瓶。使組織小塊均勻地分布于生長瓶內壁表面上。把瓶蓋蓋上，放入恒溫培養(yǎng)箱內或放入36.5℃暖房內，靜置18～24 h。

E．待組織塊均已沾附玻壁上后，經過3 ~5 d，在每只25 ml的培養(yǎng)瓶內加5 ml培養(yǎng)液，然后每周更新培養(yǎng)液一次。培養(yǎng)3～5周，組織塊周圍的生長暈不斷地增長，當細胞從組織向四周伸展，細胞生長較多時用肉眼或低倍鏡下觀察猶如日暈，稱“生長暈”。

F．將生長暈中央的組織塊用外科小刀取出，用預先濕潤的滴管移到另一新的培養(yǎng)瓶中，從步驟④起重復操作。

G．在吸去組織塊的生長暈培養(yǎng)瓶內，換入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待生長暈細胞擴展到蓋住培養(yǎng)瓶底約50%表面時，用來進行細胞培養(yǎng)。

4）單層細胞培養(yǎng)法

自20世紀50年代，細胞培養(yǎng)技術有兩個大的改進：一是在研究細胞代謝的基礎上開始應用合成培養(yǎng)基，二是采用了胰酶消化分散細胞的技術，把組織團塊分散成較小的細胞團或單個細胞。采用這些措施的結果，細胞不僅在培養(yǎng)環(huán)境中長得更好，而且由于細胞生存在液體培養(yǎng)基中，無血漿支架，只能附在瓶壁上長成單層，形成所謂單層細胞培養(yǎng)。

單層細胞培養(yǎng)更進一步促進了組織培養(yǎng)法的發(fā)展。由于單層細胞便于傳代和觀察，從而演變出了建立長期傳代的細胞系和單細胞分離培養(yǎng)純細胞株的技術，使組織培養(yǎng)技術更趨完善。

單層細胞培養(yǎng)有下列幾點好處：
①更換新鮮培養(yǎng)液比較容易，可先用血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，然后可方便地換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，用于觀察某些因子加到培養(yǎng)液后的作用，以及從培養(yǎng)液中減去某些因子后對細胞生長的影響；
②如實驗要求細胞密度較高時，較容易采用灌注技術提供高密度細胞所需要的營養(yǎng)成分；
③當細胞粘附在基底質上后，更容易表達某些產物；
④單層細胞培養(yǎng)更適用許多細胞系。

單層細胞培養(yǎng)法：取材后剪成1～3 mm3的小塊，經過消化分離，細胞計數，分裝入培養(yǎng)瓶中保溫培養(yǎng)。

培養(yǎng)過程中隨著細胞的增長，尤其在細胞生長十分旺盛時，代謝產物堆積，CO2增多，營養(yǎng)液氫離子濃度升高，酚紅指示劑顏色變黃。如估計營養(yǎng)成分未耗盡，此時只需加入少許NaHCO3調節(jié)即可；如營養(yǎng)成分已枯竭，則需重新更換營養(yǎng)液。在使用自控CO2溫箱時培養(yǎng)瓶塞用無菌紗布棉塞，箱內穩(wěn)定提供5% CO2，能保持培養(yǎng)液恒定pH值。

傳代培養(yǎng)：當細胞生長鋪滿瓶底，需進行傳代培養(yǎng)。細胞分裂增殖擴展連片，占滿器皿表面，這時需要對其分離，并重新培養(yǎng)，這一操作過程稱之為傳代。有80%～90%或剛剛全部匯合的細胞，是傳代的理想時期。過早，細胞產量不足；過晚，致使細胞健康狀態(tài)不佳。因此，把握好時機很重要。另外，細胞對酶的消化作用反應不一，有的敏感，有的遲鈍。根據細胞特點，適度掌握細胞消化時間和選擇適宜的方法很關鍵。處理得好，細胞損失少，細胞濃度均勻，細胞生長速度一致。

① 吸出培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液；

② 加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底；

③ 作用2～5 min，檢查，如有細胞間隙變大，細胞質回縮現象，終止消化；

④ 吸出消化液，加入Hanks液，輕輕轉動以免細胞流失，洗去殘留的消化液，如果單用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液，免洗；

⑤ 用吸管輕輕吹打瓶壁，使細胞脫落制成懸液，記數后記錄其濃度；

⑥ 重新接種培養(yǎng)。

此法可大量培養(yǎng)細胞組織，特別適用于生物制品生產，但用于經常性細胞培養(yǎng)研究則太繁瑣，易染菌。

5）組織塊單層細胞培養(yǎng)法

此法的特點在于把組織剪成更小的小塊（0.5～1 mm3大?。?，在不加任何粘著劑的情況下，由于組織體積很小，能直接附于瓶壁上，細胞自組織塊邊緣向外長出，最后連接成片形成單層細胞，從而簡化了原代單層細胞的培養(yǎng)過程。組織塊單層細胞培養(yǎng)法，是當前各培養(yǎng)室常用的初代培養(yǎng)法。