qPCR熒光定量是指在反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

　　qPCR熒光定量技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，具有特異性更強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準確、速度快、全封閉反應(yīng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，已成為*的核酸分子定量的標準方法，目前在基因表達研究和臨床疾病檢測等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用（如轉(zhuǎn)基因動植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達、基因分型）。

AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix

圖1.廣闊的定量閾

以HeLa 細胞cDNA 為稀釋液，將pUC19 質(zhì)粒進行7 個10 倍梯度稀釋，第7 個稀釋梯度中質(zhì)?？截悢?shù)濃度約為7 copies/4 μl。使用AceQ® Universal 預(yù)混液對各稀釋梯度中的pUC19 質(zhì)粒進行檢測，每孔模板使用量為4 μl。可以看到，AceQ®Universal預(yù)混液在寬廣的模板量區(qū)間內(nèi)具有線性關(guān)系，可輕松檢測出個位數(shù)拷貝的待測模板。

圖2.產(chǎn)品的特異性

對隨機選取的38 個體系進行qPCR 檢測，驗證AceQ® Universal預(yù)混液擴增特異性。通過對融解曲線分析可知，38 個體系均無非特異性擴增。說明AceQ® Universal 預(yù)混液擁有的特異性。

圖3.全平臺通用

使用AceQ® Universal 預(yù)混液在不同類型的qPCR 儀（機型：StepOnePlusTM、QuantStudioTM 3、LightCycler® 96）上擴增GAPDH 基因，定量結(jié)果很好。說明AceQ® Universal 預(yù)混液儀器適用性廣，無需針對不同儀器調(diào)整ROX 濃度。

本產(chǎn)品是使用SYBR Green I 嵌合熒光法進行qPCR的試劑，采用化學(xué)法修飾的熱啟動DNA聚合酶AceTaq® DNA Polymerase，配合針對qPCR優(yōu)化的適Buffer，可以有效抑制非特異擴增，從而顯著提高擴增效率，適用于進行高靈敏度的qPCR反應(yīng)。本產(chǎn)品是一種含有qPCR反應(yīng)適濃度SYBR Green I的2 × 預(yù)混試劑，可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標準曲線，對靶基因進行準確定量、檢測，重復(fù)性好，可信度高。另外，產(chǎn)品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適應(yīng)于所有qPCR儀器，無需在不同儀器上調(diào)整ROX的濃度，只需在配制反應(yīng)體系時加入引物和模板即可進行擴增。

Q1：如何判斷CT值有效性？

A1：(1) 融解曲線單峰（染料法）

(2) 擴增曲線指數(shù)擴增區(qū)域，復(fù)孔間CT值STD<0.2

(3) 閾值設(shè)置合理

(4) NTC確認無氣溶膠污染或可以忽略

(5) NRT確認無基因組殘留污染或可以忽略

(6) 擴增效率符合近似計算標準，標準曲線相關(guān)系數(shù)R2大于0.98，擴增效率e介于95-105%或者90-120%之間。

Q2：常見的擴增曲線異常有哪些，如何解決？

A2：(1) 擴增曲線不光滑：信號太弱，經(jīng)系統(tǒng)矯正后產(chǎn)生。建議提高模板濃度重復(fù)實驗。

(2) 擴增曲線斷裂或下滑：一般由于模板濃度較高，基線的終點值大于CT值。建議減小基線終點（CT值-4），重新分析數(shù)據(jù)。

(3) 個別擴增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。建議反應(yīng)前要仔細檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。

(4) 擴增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù)：ROX添加不當。需校正參比染料。

Q3：標準曲線擴增效率小于90%或者大于120%，線性關(guān)系不佳。

A3：(1) 加樣誤差。加大模板稀釋倍數(shù)，提高加樣體積。加大稀釋體積，使不同稀釋梯度的濃度更準確。

(2) 標準品降解。重新制備標準品，重復(fù)實驗。

(3) 模板濃度過高。存在反應(yīng)抑制，增加模板稀釋倍數(shù)。

(4) 引物擴增特異性不好。重新設(shè)計引物，重復(fù)實驗。

Q4：在定量時，如何判斷cDNA投入量。

A4：*得到的cDNA需要進行多個梯度稀釋，將不同梯度稀釋的cDNA進行qPCR定量，選取CT值落在18-28，或者15-33范圍內(nèi)的擴增曲線對應(yīng)的cDNA 稀釋梯度作為后續(xù)該基因的參考稀釋度（CT值在18-28，或者15-33區(qū)間范圍被認為是準確的）。有一點需要注意，當使用cDNA原液進行檢測的時候，使用量不能超過 qPCR體系的1/10，因為cDNA中包含很多抑制qPCR的組份，使用體積過大會導(dǎo)致擴增失敗。

Q5：如何確定基因表達量高低。

A5：如果基因擴增CT值超過30，使用PCR產(chǎn)物通過梯度稀釋創(chuàng)建標準曲線，判斷該引物擴增效率，若擴增效率滿足90-120%，則可以判斷該基因擴增CT值偏大是由于基因表達量低所致。

Q6：陰性對照出現(xiàn)明顯擴增。

A6：(1) 反應(yīng)體系污染。更換新的Mix、水、引物重復(fù)實驗。反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制，減少氣溶膠污染。

(2) 擴增為引物二聚體引起。配合融解曲線進行分析。

Q7：NRT出現(xiàn)明顯擴增。

A7：NRT出現(xiàn)明顯擴增，說明存在基因組污染，可通過實驗組和NRT的CT值來判斷實驗數(shù)據(jù)是否可用。當實驗組CT值與NRT的CT值差值大于5，說明由gDNA導(dǎo)致的誤差小于5%，則可以忽略gDNA污染；若實驗組與NRT的CT值差值小于3或者幾乎一致，則實驗組擴增產(chǎn)物的模板很大一部分來源于gDNA，這樣的實驗組就失去定量意義，建議使用去基因組的RNA提取試劑盒進行RNA提取，或者反轉(zhuǎn)錄時，加入去基因組步驟。

Q8：CT值出現(xiàn)太晚。

A8：(1) 擴增效率極低。優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設(shè)計合成引物。

(2) 模板濃度太低。減少稀釋度重復(fù)實驗，一般未知濃度的樣品先從Zui高濃度做起。

(3) 模板降解。重新制備模板，重復(fù)實驗。

(4) PCR產(chǎn)物太長。推薦PCR產(chǎn)物長度為80 bp-150 bp。

(5) 體系中存在PCR抑制劑。一般為模板帶入，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實驗。

Q9：反應(yīng)結(jié)束無擴增曲線出現(xiàn)。

A9：(1) 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠。一般設(shè)置循環(huán)數(shù)為40，但需要注意的是過多的循環(huán)會增加過多的背景信號，降低數(shù)據(jù)可信度。

(2) 確認程序中是否設(shè)置了信號采集步驟。兩部法擴增程序一般將信號采集設(shè)置在退火延伸階段；三步法擴增程序應(yīng)當將信號采集設(shè)置在72℃延伸階段。

(3) 確認引物是否降解。長時間未使用的引物應(yīng)先通過PAGE電泳檢測完整性，以排除引物降解的可能性。

(4) 模板濃度太低。減少稀釋度重復(fù)實驗，一般未知濃度的樣品先從Zui高濃度做起。

(5) 模板降解。重新制備模板，重復(fù)實驗。

Q10：融解曲線出現(xiàn)多峰。

A10：(1) 引物設(shè)計不優(yōu)。根據(jù)qPCR設(shè)計原則設(shè)計、合成新的引物。

(2) 引物濃度太高。適當降低引物濃度。

(3) cDNA模板帶有基因組污染。重新制備cDNA模板。

Q11：實驗重復(fù)性差。

A11：(1) 加樣體積失準。使用準確度較好的移液槍，擴大反應(yīng)體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中。

(2) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致。定期校準儀器。

(3) 模板濃度太低。模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。

(4) 做4-6個復(fù)孔，刪除其中重復(fù)性不好的孔，將剩余的進行后續(xù)計算。

Q12：高GC含量的模板，建議用什么產(chǎn)品進行定量？

A12：建議用Q111進行定量。

Q13：如果內(nèi)參CT值很低，目標基因CT值很高，該如何稀釋樣品？

A13：可以在定量內(nèi)參的時候?qū)⒛０逑♂?，而定量目的基因時模板不稀釋，結(jié)果仍舊采用 2-ΔΔCT進行計算，CT值減兩次，稀釋倍數(shù)會被相應(yīng)減掉，但要保證不同樣品在檢測同一基因時稀釋倍數(shù)要一致。

Q14：如何預(yù)防氣溶膠污染？

A14：在加樣的時候要小心操作，盡量在超凈工作臺中進行加樣，并注意通風。擴增反應(yīng)結(jié)束后，盡量不要打開產(chǎn)物的管蓋，不要跑膠，跑完后需要妥善處理。如果氣溶膠污染情況很嚴重，建議采用通風結(jié)合含強氧化劑的消毒液進行處理。

Q15：相對定量為什么要做標準曲線？

A15：相對定量分析中采用2-ΔΔCT公式進行計算比較不同樣品中基因的表達量時，前提是該體系的擴增效率e是盡可能接100%的。相對定量中做標準曲線的目的就是為了判斷該擴增體系中的擴增效率e是否是接近100%，能否用2-ΔΔCT公式進行計算；如果擴增效率e與100%相差很大，在比較基因表達差異時是需要帶入實際的擴增效率進行計算的。

Q16：怎么做定量？

A16：首先需要有一個已知拷貝數(shù)濃度的樣品作為標準品，將其稀釋至少5個梯度后和待測樣品同時上機進行定量檢測，以標準品拷貝數(shù)的Log值為橫坐標，以標準品的CT值為縱坐標繪制標準曲線方程，將檢測獲得的待測樣品的CT值帶入標準曲線方程中就能求得待測樣品的拷貝數(shù)濃度。

Q17：模板的稀釋液選擇。

A17：稀釋模板可以使用購買的Nuclease-free water、DEPC水或者實驗室自備的ddH2O等。TE里有EDTA會抑制酶的活性，不可作為稀釋液。